轉(zhuǎn)基因分子特征的研究方法

分子鑒定是轉(zhuǎn)基因安全性評(píng)價(jià)中重要的一步。除了在獲得轉(zhuǎn)化事件初期對(duì)轉(zhuǎn)基因整合情況進(jìn)行檢測(cè)，后續(xù)還要對(duì)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行詳細(xì)的基因水平、分子水平及生化水平分析，包括對(duì)轉(zhuǎn)基因事件染色體倍性、轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)、載體骨架整合、轉(zhuǎn)基因表達(dá)（RNA水平和蛋白質(zhì)水平）等。

1、  染色體倍性評(píng)價(jià)（Determination of ploidy）

染色體倍性評(píng)價(jià)是評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因事件的重要內(nèi)容。在轉(zhuǎn)基因的T₀代和T₁代對(duì)染色體倍性進(jìn)行鑒定是篩選轉(zhuǎn)化植株的第一步。轉(zhuǎn)基因事件應(yīng)具有與受體植株相同的染色體倍性，可以通過DNA流式細(xì)胞儀對(duì)轉(zhuǎn)基因事件的染色體倍性進(jìn)行快速鑒定。

2、  轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)分析

轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性依賴于轉(zhuǎn)基因在基因組上的整合位點(diǎn)。由于目前實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因在基因組特定位點(diǎn)整合比較困難，轉(zhuǎn)基因的整合位點(diǎn)通常是未知的。研究T-DNA的整合及整合位點(diǎn)序列信息對(duì)避免轉(zhuǎn)基因丟失具有重要意義。轉(zhuǎn)基因的側(cè)翼序列信息是轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要內(nèi)容。

物力圖譜和遺傳圖譜可以展示轉(zhuǎn)基因整合的圖景。細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)（Cytogenetic techniques）例如熒光原位雜交（FISH）可以用于研究轉(zhuǎn)基因在染色體上的整合。還可以通過反向PCR（Inverse PCR）、TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）、隨機(jī)引物PCR（random primed PCR）及接頭介導(dǎo)的PCR（adaptor ligation-mediated PCR）研究T-DNA在染色體上的整合位點(diǎn)。通過鑒定轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)基因組側(cè)翼序列，可以對(duì)轉(zhuǎn)基因是否破壞功能及調(diào)控基因、是否產(chǎn)生新的閱讀框架（ORFs）從而導(dǎo)致新的嵌合蛋白產(chǎn)生等內(nèi)容進(jìn)行評(píng)價(jià)。側(cè)翼序列信息可以進(jìn)一步用于轉(zhuǎn)基因純合植株的鑒定。

轉(zhuǎn)基因在植物基因組中的整合不可避免的破會(huì)植物內(nèi)源DNA的序列，并且可能伴隨著基因的修飾或者沉默、突變及多效性影響。為準(zhǔn)確判斷轉(zhuǎn)基因可能引起的插入突變需要對(duì)轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)處轉(zhuǎn)基因序列、冗余DNA序列及側(cè)翼植物基因組序列等內(nèi)容進(jìn)行全面的研究，需要比較插入位點(diǎn)序列與非轉(zhuǎn)基因受體品種該位點(diǎn)處的序列。

3、  轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和遺傳

轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和穩(wěn)定性。為分析轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)需要對(duì)轉(zhuǎn)基因及側(cè)翼序列進(jìn)行全面的測(cè)序。需要對(duì)轉(zhuǎn)基因片段的內(nèi)部是否存在直接重復(fù)、反向重復(fù)、串聯(lián)重復(fù)、富含AT序列、衛(wèi)星序列、回文序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等內(nèi)容進(jìn)行分析。

在分子水平對(duì)轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)進(jìn)行分析并且分析轉(zhuǎn)基因編碼的表型在后代中的分離可以用于研究轉(zhuǎn)基因的遺傳。通過比較初代轉(zhuǎn)基因事件和后代轉(zhuǎn)基因事件轉(zhuǎn)基因的雜交帶型可以分析轉(zhuǎn)基因在后代中的遺傳，通過回交可以分析轉(zhuǎn)基因通過有性生殖傳遞的穩(wěn)定性，并且可以分析轉(zhuǎn)基因的遺傳是否符合孟德爾遺傳定律。